BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Tujuan Percobaan
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari teknik-teknik isolasi dan kultivasi (pemeliharaan) mikroba.
1.2 Latar Belakang
Mikroorganisme sebagai makhluk hidup sama dengan organisme hidup lainnya sangat memerlukan energi dan bahan-bahan untuk membangun tubuhnya, seperti dalam sintesis protoplasma dan bagian-bagian sel lainnya. Bahan-bahan tersebut disebut nutrien. Untuk memanfaatkan bahan-bahan tersebut, maka sel melakukan suatu kegiatan-kegiatan, sehingga menyebabkan perubahan kimia di dalam selnya. Semua reaksi yang teratah yang berlangsung di dalam sel ini disebut metabolisme. Metabolisme yang melibatkan berbagai macam reaksi di dalam sel tersebut, hanya dapat berlangsung atas bantuan dari suatu senyawa organik yang disebut juga biokatalisator yang dinamakan enzim (Djide, 2006).
Peran utama nutrien adalah sebagai sumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yang menghasilkan energi). Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukan terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. “Selain itu, secara umum nutrient dalam media pembenihan harus mengandung seluruh elemen yang penting untuk sintesis biologik oranisme baru (Jawetz, 2001).
Saat ini media agar merupakan media yang sangat umum digunakan dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Media agar ini memungkinkan untuk dilakukannya isolasi bakteri dari suatu sampel, karakterisasi morfologi, sampai penghitungaan bakteri yang dikenal dengan nama total plate count. Bentuk koloni bakteri dan warna-warninya mudah sekali dikenali dengan media ini dengan cara mengubah komposisi nutrien atau menambahkan indikator (Achmad, 2007).
BAB II
DASAR TEORI
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrien) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis dan perhitungan sejumlah mikroba. Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat, antara lain : harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan tumbuh, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik (Sutedjo, 1990).
Suatu medium yang mengandung substansi kompleks seperti ekstrak daging sapi, ekstrak khamir, tripton, dan darah disebut sebagai medium buatan atau medium kompleks (artificial or complex medium). Sebagai lawannya, kita acu medium yang rumus kimia masing-masing ramuannya dapat dituliskan sebagai medium sintesis (synthtetical medium) atau medium yang ditentukan (difined medium). Medium sintesis mungkin sangat rumit dan sangat berbeda sesuai dengan organisme tertentu yang hendak ditumbuhkan. Untuk sebagian besar, medium sintesis hanya digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di laboratorium penelitian (Volk & Wheeler, 1993).
Agar-agar, gelatin atau gel silika merupakan bahan untuk membuat medium menjadi padat. Namun, yang paling umum digunakan adalah agar-agar. Meskipun bahan utama agar-agar adalah gelatin, yaitu suatu kompleks karbohidrat yang diekstraksi dari alga marin genus gelidium, namun sebagian mikroorganisme tidak dapat menggunakannya sebagai makanan sehingga agar-agar dapat berlaku hanya sebagai pemadat (Hadioetomo, 1993).
Untuk perhitungan mikroorganisme mungkin yang paling sering digunakan adalah prosedur penumbuhan dalam agar. Secara sederhana suatu contoh suspensi sel atau bahan pangan homogenat diinokulasi ke dalam atau ke atas media nutrien agar dan setelah diinkubasi, jumlah koloni yang terbentuk dihitung. Karena satu koloni menunjukkan jumlah sel dalam larutan asalnya (Buckle, 1985).
Perhitungan secara penumbuhan dalam cawan petri dapat dilakukan dengan menggunakan tiga metode yaitu : dalam metode penuangan, 1,0 ml contoh dipindahkan ke dasar cawan dan dituangkan diatasnya 15-20 ml media agar yang telah didinginkan sampai 45o – 50oC dan dicampur serata mungkin. Setelah inkubasi, koloni baik yang tumbuh di dalam agar atau dipermukaannya dihitung. Prosedur ini termasuk yang paling peka, sampai sejumlah 20 sel/ml dapat dihitung. Metode ini tidak dapat diterapkan dalam studi lapangan karena dibutuhkan alat-alat untuk mencairkan dan mendinginkan media agar. Berikutnya metode penyebaran pada permukaan cawan dilakukan dengan menggunakan 0,1 ml larutan contoh disebaratakan di permukaan media agar yang tersedia dengan tongkat gelas yang melengkung (bent glass rod) yang telah disterilkan. Setelah inkubasi, koloni yang tumbuh di permukaan dari media dihitung. Karena penggunaan volume larutan yang sedikit yaitu 0,1 ml, maka kepekaannya sekitar 300 sel/ml. Oleh karena media agar dalam cawan telah disiapkan lebih dahulu, maka metode ini dapat diterapkan dalam studi lapangan. Dan terakhir adalah metode penetesan pada cawan, media yang dipersiapkan terlebih dahulu dibagi-bagi menjadi 3 atau 4 sektor dan setetes larutan contoh (0,02 ml) dipindahkan ke masing-masing sektor. Setelah tetesan tersebut dibiarkan kering, cawan petri kemudian diinkubasi. Suatu pipet penetes yang telah dikalibrasi dipergunakan untuk mengukur dan memindahkan tetesan. Pengenceran contoh diatur sedemikian rupa sehingga diperoleh antara 5 sampai 20 koloni terbentuk dari setiap tetesan pada permukaan media agar. Satu keuntungan metode ini adalah bahwa perhitungan dapat dilakukan 3-4 kali ulangan sekaligus dalam satu cawan, sehingga dapat menghemat bahan-bahan untuk uji mikrobiologi. Contoh bahan yang mengandung sekecil 250 sel setiap ml masih dapat dihitung dan teknik ini dapat diterapkan dalam percobaan-percobaan lapangan (Buckle, 1985).
Keragaman yang luas dalam hal tipe nutrisi diantara mikroorganisme diimbangi oleh tersedianya berbagai media yang banyak macamnya untuk kultivasinya. Macam media yang tersedia dapat dikelompokkan dengan berbagai cara. Selain menyediakan nutrien yang sesuai untuk kultivasi mikroorganisme, juga perlu disediakan kondisi fisik yang memungkinkan pertumbuhan optimum. Mikroorganisme tidak hanya amat bervariasi dalam persyaratan nutrisinya, tetapi juga menunjukkan respons yang berbeda-beda terhadap kondisi fisik di dalam lingkungannya. Untuk keberhasilan kultivasi berbagai tipe bakteri, dibutuhkan satu kombinasi nutrien serta lingkungan fisik yang sesuai. Perkembangbiakkan bakteri dipengaruhi beberapa faktor, yaitu ;
a. Suhu
b. Cahaya
c. Pengeringan (kelembaban)
d. Keasaman (pH)
e. Pengaruh O2 dari udara
f. Pengaruh tekanan osmotik
g. Pengaruh mikroorganisme disekitarnya
h. Pengaruh zat kimia
Koloni bakteri memiliki beberapa ciri berdasarkan bentuk, tepian, dan elevasinya:
1. Berdasarkan bentuk, contohnya
a. Bundar
b. Bundar dengan tepian kerang
c. Bundar dengan tepian timbul
d. Keriput
e. Tak beraturan dan menyebar
2. Berdasarkan tepian, contohnya :
a. Licin
b. Berombak
c. Berlekuk
d. Tak beraturan
e. Siliat
3. Berdasarkan elevasi, contohnya :
a. Datar
b. Timbul
c. Cembung
d. Seperti tetesan
e. Seperti tombol
Sifat-sifat yang perlu diperhatikan pada koloni yang tumbuh dipermukaan medium yaitu :
a. Besar kecilnya koloni
b. Bentuk
c. Kenaikan permukaan
d. Halus kasarnya permukaan
e. Wajah permukaan
f. Warna
g. Kepekaan
Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan dan tepi. Sedangkan sifat-sifat koloni pada agar-agar miring berisikan pada bentuk dan tepi koloni. Jamur merupakan salah satu anggota dari fungi. Kadang pertumbuhannya pada makanan mudah dilihat karena tampak berserabut seperti kapas. Mula-mula berwarna putih à jika sudah ada spora à terbentuk warna (tergantung jenis jamurnya). Ada tiga macam morfologi hifa, yaitu :
a. Aseptat atau senosit
b. Septat dengan sel-sel uninukleat
c. Septat dengan sel-sel multinukleat
Nama jenis jamur yang sering ditemui adalah sebagai berikut :
1. Penicillium : hijau kebiruan, susunan konidia seperti sapu
2. Aspergillus : hijau kebiruan dengan area kuning sulfur pada permukaannya
3. Verticillium : coklat merah muda, konidia berbentuk elips
4. Irichoderma : hijau, secara makroskopis menyerupai penicillium
5. Gliocladium : hijau kehitaman, tumbuh lebih cepat dari 1 dan 2
6. Hormodendrum : permukaan hijau muda sampai kelabu, permukaan bagian bawah berwarna kelabu sampai hitam
7. Pleopora : permukaan sawo matang sampai hijau dengan permukaan belakang coklat sampai hitam, memperlihatkan oskospora
8. Scopulariopsisi : coklat muda, konidia berdinding kasar
9. Paecilomyces : coklat kekuningan, konidia berbentuk elips
10. Alternaria : permukaan hitam dengan tepian kelabu, permukaan belakang berwarna hitam
11. Helminthosporium : permukaan hitam dengan tepian kelabu
12. Pullularia : permukaan hitam, mengkilat, seperti kulit, berdinding tebal dengan spora menguncup
13. Oospora : permukaan berwarna kulit hifa pecah menjadi sel-sel berbentuk persegi panjang dan berdinding tipis.
Di alam bebas tidak ada bakteri yang hidup sendiri terlepas dari spesies lainnya. Di laboratorium, supaya kita hanya mendapat satu spesies saja dalam suatu biakan campuran menjadi biakan murni memerlukan teknik-teknik untuk mengisolasi. Populasi campuran menjadi satu populasi sel. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri dari satu populasi jenis mikroba yang semuanya berasal dari satu sel induk. Isolasi bakteri artinya memisahkan satu jenis bakteri dari biakan campuran menjadi biakan murni. Untuk mengisolasi suatu spesies dikenal beberapa cara, yaitu :
1. Cara cawan gores
2. cara cawan tuang
3. Cara cawan sebar
(Caray, 2008).
BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Alat
Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah cawan petri steril, tabung reaksi steril, jarum ose dan lampu bunsen.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah akuades, alkohol 70 %, medium NA, PDA , MEA dan biakan murni.
3.3 Prosedur Kerja
1. Disiapkan jarum ose.
2. Diambil 2 tabung reaksi, tabung 1 sebagai medium steril dan tabng 2 sebagai biakan murni. Dipegang tabung tersebut di tangan kiri dan ose di tangan kanan.
3. Dipanaskan ose dengan bunsen sampai pijar. Digerakkan naik turun supaya pemanasan terjadi sampai batas jarum.
4. Dinginkan ose selama 30 detik untuk mencegah mikroba mati.
5. Diangkat sumbat kedua tabung satu demi satu dengan kelingking kanan untuk tabung dua dan jari manis untuk tabung satu.
6. Dipanaskan mulut tabung dengan bunsen bolak-balik sebanyak 2 kali.
7. Digoreskan ose dengan metode gores untuk biakan E.Coli dan Saccaharomyces sp. dan untuk Aspergillus sp. hanya di titik kan saja pada media.
8. Panaskan kembali mulut tabung reaksi dan tutup lagi dengan sumbat.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
Tabel 4.1.1 Kultivasi Bakteri E. coli
| No. | Gambar | Kode Isolat | Jumlah Koloni | Bentuk | Tepian | Warna | Elevasi |
| 1. | | NA1 (1) | 35 | Berbenang-benang | Bercabang | Putih susu | Cembung |
| 2. | | NA2 (1) | 45 | Rizoid | Tak beraturan | Putih susu | Cembung |
| 3. | | NA3 (1) | 25 | Tak beraturan dan menyebar | Berombak | Putih susu | Cembung |
| 4. | | NA1 (4) | 8 | Bundar dan tepian menyebar | Bercabang | Putih susu | Datar |
| 5. | | NA2 (4) | 19 | Konsentris | Tak beraturan | Putih susu | Cembung |
| 6. | | NA3 (4) | 49 | Tak beraturan dan menyebar | Berombak | Putih susu | Seperti kawah |
Tabel 4.1.2 Kultivasi Jamur Aspergillus sp.
| No. | Gambar | Kode Isolat | Jumlah Koloni | Bentuk | Tepian | Warna | Elevasi |
| 1. | | PDA1 (2) | 50 | Filiform | Wol | Hitam | Tombol |
| 2. | | PDA2 (2) | 79 | L | Wol | Hitam | Tombol |
| 3. | | PDA3 (2) | 111 | Filiform | Wol | Hitam | Kawah |
| 4. | | PDA1 (5) | 66 | Bundar menyebar | Wol | Hitam | Kawah |
Tabel 4.1.3 Kultivasi Khamir Saccaromyces
| No. | Gambar | Kode Isolat | Jumlah Koloni | Bentuk | Tepian | Warna | Elevasi |
| 1. | | MEA1 (3) | 130 | L | Licin | Putih susu mengkilap | Tombol |
| 2. | | MEA2 (3) | 43 | L | Licin | Putih susu mengkilap | Tombol |
| 3. | | MEA3 (3) | 53 | L | Licin | Putih susu mengkilap | Tombol |
| 4. | | MEA1 (6) | 68 | L | Licin | Putih susu mengkilap | Tombol |
| 5. | | MEA2 (6) | 116 | L | Licin | Putih susu mengkilap | Tombol |
| 6. | | MEA3 (6) | 93 | L | Licin | Putih susu mengkilap | Tombol |
4.2 Pembahasan
Isolasi suatu mikroba adalah memisahkan mikroba tersebut dari lingkungannya di alam bebas dan menumbuhkannya sebagai kultur murni atau biakan murni dalam medium buatan. Pada saat isolasi mikroba perlu dilakukan inokulasi mikroba. Sebelum dan sesudah menginokulasikan mikroba jarum ose yang digunakan harus dipanaskan terlebih dahulu. Hal ini bertujuan agar jarum ose yang digunakan bersifat steril dan bebas kontaminasi dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sedangkan pada cawan petri, setelah sampel dimasukan kedalam cawan petri setiap membuka dan menutup cawan petri harus terlebih dahulu dipanaskan untuk meminimalkan terkontaminasinya sampel. Wadah media yang menggunakan cawan petri, pada saat inkubasi mikroba pada cawan petri selalu dalam posisi terbalik. Hal ini dimaksudkan untuk mencegah mikroba terkena uap air yang dihasilkan pada saat inkubasi. Sehingga kualitas mikroba tidak rusak atau mengalami gangguan.
Teknik-teknik dalam mengisolasi mikroba terbagi menjadi beberapa metode, yaitu :
1. Teknik Penggoresan (steak plate)
Teknik Penanaman dengan teknik Goresan (Streak) bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. Ada beberapa teknik goresan yang biasa dipakai yaitu :
A. Goresan Sinambung
Seperti gambar di bawah ini :
B. Goresan T
Seperti gambar di bawah ini :
C. Goresan Kuadran (Streak quadrant)
Seperti gambar di bawah ini :
Prinsip teknik penggoresan yaitu pengenceran dimana goresan pertama paling pekat kemudian menjadi semakin encer sampai pada goresan ke empat yang terletak ditengah-tengah media. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satu sel.
2. Teknik Taburan (pour plate)
Teknik isolasi mikroba dengan cara menaburkan mikroba pada permukaan media yang akan digunakan.
3. Teknik Sebar (spread plate)
Teknik isolasi dan mikroba dengan cara menyebarkan mikroba pada permukaan media yang akan digunakan.
4. Teknik Pengenceran (dilution method)
Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam mdium tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika kita belum yakin, Bahwa koloni tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang murni, maka kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.
5. Teknik Micromanipulator
Mengambil satu bakteri dengan mikropipet yang ditempatkan dalam mikro manupulator, kemudian ditempatkan dalam mikromanupulator. Kemudian ditempatkan dalam medium encer untuk dibiakkan.
Dalam proses isolasi dan kultivasi dibutuhkan suatu media yang digunakan sebagai tempat tumbuhnya mikroba. Media yang digunakan berbeda-beda sesuai jenis mikroba yang ditumbuhkan. Untuk mikroba bakteri digunakan media NA (Nutrient Agar), untuk fungi digunakan Potato Destroxe Agar (PDA) dan untuk khamir digunakan media Malt Extract Agar (MEA). Media yang digunakan berbeda-beda karena untuk mengisolasi mikroba perlu memperhatikan media yang tepat untuk mikroba tersebut. Dilihat dari pH, suhu dan ketersediaan nutrien yang cocok pada media bagi mikroba yang ditumbuhkan.
Pada percobaan ini menggunakan teknik goresan pada petridish dan tabung reaksi dan juga menggunakan metode zig-zag. Ini merupakan cara sterilisasi umum secara aseptik, yang di buat ada 4 kuadran zig-zag, supaya koloni bakteri yang terbentuk bisa tumbuh dan bisa dilihat dengan jelas. Teknik ini digunakan untuk mikroba bakteri dan khamir. Sedangkan untuk jamur menggunakan metode titik karena jamur memiliki spora yang akan rusak jika digunakan metode gores. Dari hasil percobaan didapatkan hasil untuk untuk isolasi dan kultivasi bakteri E. coli, jumlah koloni terbanyak didapatkan pada isolat dengan kode NA3 (4) sebanyak 49. Sementara untuk bentuk koloni berbeda-beda untuk setiap sampel, yaitu ada yang berbentuk berbenang-benang, rhizoid, konsentris, tak beraturan dan menyebar, serta tak berbentuk dan menyebar. Perbedaan bentuk ini diakibatkan perbedaan pada saat penggoresan mikroba. Bentuk tepiannya berbentuk bercabang, tak beraturan dan berombak. Sedangkan warna untuk setiap koloni adalah putih susu. Sementara bentuk koloninya berbentuk cembung dan seperti kawah.
Sedangkan untuk isolasi dan kultivasi jamur Aspergillus sp. dengan media PDA, jumlah koloni terbanyak didapatkan pada isolat dengan kode PDA3 (2) sebanyak 111. Bentuk koloni ada yang berbentuk filiform, L, bundar dan menyebar. Warna untuk setiap koloni adalah hitam dan tepian untuk semua sampel adalah berbentuk wol. Sementara bentuk elevasinya adalah tombol dan kawah. Untuk isolasi dan kultivasi khamir yaitu Saccaromyces menggunakan media MEA, jumlah koloni terbanyak didapatkan pada isolat dengan kode MEA1 (3) dengan jumlah koloni sebanyak 130. Bentuk koloni berbentuk L untuk setiap sampel. Warna untuk setiap koloni adalah putih mengkilap dan tepian untuk semua sampel adalah berbentuk licin. Sementara bentuk elevasinya adalah tombol. Pengamatan untuk bentuk koloni dilihat dari atas, permukaan koloni dilihat dari samping dan tepi koloni dilihat dari atas. Sedangkan jumlah koloni dihitung dari colony counter.
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang didapat dari percobaan ini adalah:.
1. Komposisi media bahan sangat penting dalam memenuhi kebutuhan nutrisi bakteri demi mengoptimalkan pertumbuhannya, yang mana tiap-tiap komposisi harus setimbang jumlahnya.
2. Teknik penanaman dapat dilakukan dengan cara gores dan titik.
3. Media NA untuk bakteri, PDA untuk jamur dan MEA untuk khamir.
4. Pada kultivasi mikroba, harus dilakukan sterilisasi terlebih dahulu untuk mencegah kontaminasi
5.2 Saran
Saran-saran untuk percobaan ini adalah hendaknya praktikan lebih teliti saat penanaman media agar jangan sampai sampel terkontaminasi dan praktikan harus lebih teliti dalam menghitung jumlah koloni dengan mengunakan colony counter.
DAFTAR PUSTAKA
Achmad. Dinoto. 2007. Media Agar: Ide Besar Istri Peneliti.
Diakses tanggal 3 November 2008.
Buckle, K.A, dkk. 1985. Ilmu Pangan. Penerbit Universitas Indonesia: Jakarta.
Caray. 2008. Pembuatan Media Agar dan Sterilisasi.
Diakses pada tanggal 10 November 2010
Hadioetomo, R. S.. 1993. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi. Gramedia: Jakarta.
Sutedjo. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta: Jakarta.
Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar, Jilid 1, Edisi kelima. Erlangga:
Jakarta.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar